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Etablierung eines mikrofluidischen 3D-Bioreaktors zur Untersuchung des transendothelialen Transports in vitro
Die vorliegende Arbeit beschreibt die erfolgreiche Entwicklung eines mikrofluidischen Bioreaktors zur Untersuchung des Blutgefäßsystems in vitro. Das zentrale Element des Bioreaktors ist ein gekrümmter, poröser Mikrokanal, der das künstliche Blutgefäß darstellt. Die zur Herstellung der Mikrokanäle eingesetzte SMART Technologie ist ein Thermoformverfahren zur Bearbeitung dünner Polymerfolien, die das Thermoformen bereits modifizierter Folien ermöglicht. Als Vorstufe zur Etablierung der Kultivierung von Endothelzellen in den porösen Mikrokanälen wurde ein neues Boyden Chamber System entwickelt, welches den transendothelialen Transport durch einen porösen, gekrümmten Halbkanal ermöglicht. Durch Darstellung der Krümmungsradien von Blutgefäßen in diesem Halbkanal können so in vivo Bedingungen nachgeahmt werden. Humane Endothelzellen konnten erfolgreich zur Konfluenz kultiviert werden. Dabei zeigte sich ein Unterschied in der Morphologie zwischen Endothelzellen, die auf flachen Oberflächen kultiviert wurden, im Gegensatz zu Zellen auf gekrümmten Oberflächen. Durch Schließen des porösen Halbkanals mittels thermischem Bonden, sowie Ausstattung des Mikrokanals mit Anschlüssen für ein Pumpsystem, konnte ein mikrofluidisches System entwickelt werden. Dieses erlaubt die Untersuchung des vaskulären Systems unter Scherstress Bedingungen. Der Mikrokanal wird von einer zweiten Kammer umgeben, die zur Aufnahme transportierter Substanzen, aber auch zur Kultivierung einer Ko Kultur eingesetzt werden kann. Erste Ko Kultur Experimente zeigten eine erfolgreiche Kultivierung von Fibroblasten und humanen Brustkrebszellen im angrenzenden Kompartiment. Verschiedene Reaktionen der Endothelzellen im Mikrokanal auf Scherstress Bedingungen konnten mit Hilfe des mikrofluidischen Bioreaktors nachgewiesen werden. Unter anderem wurde die Ausrichtung der Zellen in Flussrichtung sowie eine Veränderung im Aktin Zytoskelett durch die Bildung von Stress Fibers und eine erhöhte Stickstoffmonoxid (NO) Produktion gezeigt. Weiterhin konnte der Bioreaktor erfolgreich zur Simulierung einer Entzündungsreaktion und damit verbundenen Rekrutierungsprozessen von Immunzellen eingesetzt werden. Konfokale Spinning Disk Mikroskopie ermöglichte eine direkte Visualisierung des ‚Rollings‘; der Adhäsion und Transmigration der Monozyten. Einen weiteren Einsatz fand der Bioreaktor in der Untersuchung des transendothelialen Transports von polykationischen Peptoiden. Zur Bestätigung der Einsatzmöglichkeit dieser Peptoide in Zellkultur Experimenten wurde mit Hilfe eines Zytotoxizitätstest deren Einfluss auf die Zellaktivität untersucht. In den eingesetzten Konzentrationen zeigten die Peptoide keine oder nur geringe Zytotoxizität. Mit Hilfe konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnte die erfolgreiche Aufnahme der Peptoide in Endothelzellen nachgewiesen werden. Mechanistische Untersuchungen ergaben eine Beteiligung endozytotischer Wege bei der Aufnahme der Peptoide. Die quantitative Untersuchung der Peptoid Aufnahme in Endothelzellen ergab eine erhöhte Aufnahme guanidinylierter Peptoide im Vergleich zu deren Amin Analoga, sowohl bei Peptoiden mit aliphatischen als auch aromatischen Seitenketten. Der neu entwickelt mikrofluidische Bioreaktor mit dem gekrümmten künstlichen Blutgefäß bietet somit eine Plattform für zahlreiche Untersuchungen, sowohl des Endothels in seiner natürlichen, gekrümmten Form unter fluidischen Bedingungen, als auch verschiedener transendothelialer Transportprozesse. Durch Variation der Kanalgeometrien oder der Poren kann der Bioreaktor optimal an die entsprechenden Voraussetzungen der Experimente angepasst werden.
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